Produktoj
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR-detektila ilaro por 2019-nCoV
Atendata uzado
Ĉi tiu ilaro estas uzata por la kvalita detekto de nova koronaviruso (2019-nCoV) uzante gorĝajn vatbulojn, nazofaringajn vatbulojn, bronkoalveolaran lavaĵlikvaĵon, kaj sputon. La detektorezulto de ĉi tiu produkto estas nur por klinika referenco, kaj ĝi ne devus esti uzata kiel la sola pruvo por klinika diagnozo kaj kuracado. Ampleksa analizo de la stato estas rekomendinda kune kun la klinikaj manifestiĝoj de la paciento kaj aliaj laboratoriotestoj.
Inspektada principo
La ilaro baziĝas sur unu-paŝa RT-PCR-teknologio. Fakte, la genoj ORF1ab kaj N de la nova koronaviruso de 2019 (2019-nCoV) estis elektitaj kiel la celaj regionoj por amplifikado. Specifaj komenciloj kaj fluoreskaj sondiloj (sondiloj de la geno N estas etikeditaj per FAM kaj sondiloj de ORF1ab estas etikeditaj per HEX) estas desegnitaj por detekti RNA-on de la nova tipo de koronaviruso de 2019 en specimenoj. La ilaro ankaŭ inkluzivas endogenan internan kontrolan detektan sistemon (sondilo de interna kontrola geno etikedita per CY5) por monitori la procezon de specimenkolektado, RNA kaj PCR-amplifikado, tiel reduktante falsnegativajn rezultojn.
Ĉefaj komponantoj
| Komponantoj | Volumeno（48T/Kompleto） |
| RT-PCR-reakcia solvaĵo | 96µl |
| nCOV-enkonduko TaqMan sondamiksaĵo (ORF1ab, N-geno, RnaseP-geno) | 864µl |
| Negativa kontrolo | 1500µl |
| nCOV Pozitiva kontrolo（l ORF1ab N Gene） | 1500µl |
Propraj reakciaĵoj: RNA-ekstraktado aŭ purigado. Negativa/pozitiva kontrolo: La pozitiva kontrolo estas RNA enhavanta la celan fragmenton, dum la negativa kontrolo estas akvo sen nuklea acido. Dum uzo, ili devas partopreni en la ekstraktado kaj esti konsiderataj infektaj. Ili devas esti manipulitaj kaj forigitaj laŭ koncernaj regularoj.
La interna referencgeno estas la homa RnaseP-geno.
Konservaj kondiĉoj kaj limdato
-20 ± 5 ℃, evitu ripetan frostigon kaj degeladon pli ol 5 fojojn, valida dum 6 monatoj.
Aplikebla instrumento
Kun FAM / HEX / CY5 kaj aliaj plurkanalaj fluoreskaj PCR-instrumentoj.
Specimenaj postuloj
1. Aplikeblaj specimentipoj: gorĝaj vatbuloj, nazofaringaj vatbuloj, bronkoalveola lava fluido, sputo.
2. Specimenkolekto (asepsa tekniko)
Faringa vatbulo: Viŝu la tonsilojn kaj malantaŭan faringan muron per du vatbuloj samtempe, poste mergu la vatbuklon en provtubon enhavantan la provaĵsolvaĵon.
Ekspektoraĵo: Post kiam la paciento havas profundan tusadon, kolekti la tusitan ekspektoraĵon en ŝraŭbkovrila provtubo enhavanta la provan solvaĵon; bronkoalveola lava fluido: Specimenado fare de medicinaj profesiuloj. 3. Stokado kaj transportado de specimenoj
Specimenoj por virusa izolado kaj RNA-testado estu testitaj kiel eble plej baldaŭ. Specimenoj, kiuj povas esti detektitaj ene de 24 horoj, povas esti konservitaj je 4℃; tiuj, kiuj ne povas esti detektitaj ene de 24
horoj devus esti konservitaj je -70℃ aŭ malpli (se ne ekzistas stokada kondiĉo de -70℃, ili devus esti
provizore stokita je -20℃ (fridujo). Specimenoj evitu ripetan frostigon kaj degeladon dum transportado. Specimenoj estu senditaj al la laboratorio kiel eble plej baldaŭ post kolektado. Se specimenoj bezonas esti transportitaj trans longajn distancojn, oni rekomendas stokadon en sekglacio.
Testmetodoj
1 Specimena prilaborado kaj RNA-ekstraktado (specimena prilabora areo)
Estas rekomendinde preni 200 μl da likva specimeno por RNA-ekstraktado. Por rilataj ekstraktaj paŝoj, vidu la instrukciojn de komercaj RNA-ekstraktaj ilaroj. Kaj la negativa kaj negativa
kontroloj en ĉi tiu ilaro estis implikitaj en la ekstraktado.
2 PCR-reakciaĵa preparado (reakciaĵa preparo-areo)
2.1 Forigu ĉiujn komponantojn el la ilaro kaj degelu kaj miksu je ĉambra temperaturo. Centrifugigu je 8.000 rpm dum kelkaj sekundoj antaŭ uzo; kalkulu la bezonatan kvanton da reakciaĵoj, kaj la reakcia sistemo estas preparita kiel montrite en la sekva tabelo:
| Komponantoj | N-porcio (25µl sistemo) |
| nCOV-enkonduko TaqMan-sonda miksaĵo | 18 µl × N |
| RT-PCR-reakcia solvaĵo | 2 µl × N |
| *N = nombro de testitaj specimenoj + 1 (negativa kontrolo) + 1 (nCOV)pozitiva kontrolo) | |
2.2 Post ĝisfunda miksado de la komponantoj, centrifugigu dum mallonga tempo por ke la tuta likvaĵo sur la tubmuro falu al la fundo de la tubo, kaj poste alikvotu la 20 µl da amplifika sistemo en la PCR-tubon.
3 Specimenado (specimena preparo-areo)
Aldonu 5 μl da la negativa kaj pozitiva kontroloj post ekstraktado. La RNA de la testota specimeno estas aldonita al la PCR-reakcia tubo.
Fermu la tubon firme kaj centrifugigu je 8.000 rpm dum kelkaj sekundoj antaŭ ol translokigi ĝin al la plifortiga detektareo.
4 PCR-amplifo (ampligita detektareo)
4.1 Metu la reakcian tubon en la specimenan ĉelon de la instrumento, kaj agordu la parametrojn jene:
| scenejo | Ciklo nombro | Temperaturo(°C) | Tempo | kolektoretejo |
| Inversigitransskribo | 1 | 42 | 10 minutoj | - |
| Antaŭ-denaturigon | 1 | 95 | 1 minuto | - |
| Ciklo | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30-aj jaroj | datenkolektado |
Elekto de la instrumento-detektokanalo: Elektu la FAM, HEX, CY5-kanalon por la fluoreska signalo. Por referenca fluoreska signalo NONE, bonvolu ne elekti ROX.
5 Analizo de rezultoj (Bonvolu rilati al la eksperimentaj instrukcioj de ĉiu instrumento por agordo)
Post la reakcio, konservu la rezultojn. Post la analizo, ĝustigu la komencan valoron, finan valoron kaj sojlan valoron de la bazlinio laŭ la bildo (la uzanto povas ĝustigi laŭ la efektiva situacio, la komenca valoro povas esti agordita al 3~15, la fina valoro povas esti agordita al 5~20) en la logaritma grafikaĵo. Ĉe la sojlo de la fenestro, la sojla linio estas en la logaritma fazo, kaj la plifortiga kurbo de la negativa kontrolo estas rekta linio aŭ sub la sojla linio.
6 Kvalitkontrolo (Procedura kontrolo estas inkluzivita en la testo) Negativa kontrolo: Neniu evidenta plifortiga kurbo por FAM, HEX, CY5 detektaj kanaloj
COV-pozitiva kontrolo: evidenta plifortiga kurbo de FAM kaj HEX-detektokanaloj, Ct-valoro ≤32, sed neniu plifortiga kurbo de CY5-kanalo;
La supraj postuloj devas esti plenumitaj samtempe en la sama eksperimento; alie, la eksperimento estas malvalida kaj bezonas esti ripetata.
7 Determino de rezultoj.
7.1 Se ne estas plifortiga kurbo aŭ Ct-valoro > 40 en la FAM kaj HEX kanaloj de la testspecimeno, kaj estas plifortiga kurbo en la CY5-kanalo, oni povas taksi, ke ne estas RNA de la nova koronaviruso de 2019 (2019-nCoV) en la specimeno;
.2 Se la testspecimeno havas evidentajn plifortigajn kurbojn en la FAM kaj HEX kanaloj, kaj la Ct-valoro estas ≤40, oni povas taksi, ke la specimeno estas pozitiva por la nova koronaviruso de 2019 (2019-nCoV).
7.3 Se la test-specimeno havas klaran plifortigan kurbon nur en unu kanalo de FAM aŭ HEX, kaj la Ct-valoro estas ≤40, kaj ne estas plifortiga kurbo en la alia kanalo, la rezultoj devas esti retestitaj. Se la retest-rezultoj estas koheraj, la specimeno povas esti taksita kiel pozitiva por la nova
koronaviruso 2019 (2019-nCoV). Se la rezulto de la reta testo estas negativa, oni povas taksi, ke la specimeno estas negativa por la nova koronaviruso de 2019 (2019-nCoV).
Pozitiva juĝvaloro
La metodo de ROC-kurbo estas uzata por determini la referencan CT-valoron de la ilaro, kaj la interna kontrola referenca valoro estas 40.
Interpreto de testrezultoj
1. Ĉiu eksperimento estu testita por negativaj kaj pozitivaj kontroloj. Testrezultoj povas esti determinitaj nur kiam kontroloj plenumas la postulojn pri kvalito-kontrolo.
2. Kiam la FAM kaj HEX detektokanaloj estas pozitivaj, la rezulto de la CY5-kanalo (interna kontrolkanalo) povas esti negativa pro sistemkonkurado.
3. Kiam la rezulto de la interna kontrolo estas negativa, se la FAM kaj HEX detektokanaloj de la provtubo ankaŭ estas negativaj, tio signifas, ke la sistemo estas malŝaltita aŭ la operacio estas malĝusta, kaj la testo estas malvalida. Tial, la specimenoj devas esti retestitaj.
